专家论坛|遗传性铜代谢异常的致病机制及临床诊断

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陈淑如， 崇雨田， 李新华中山大学附属第三医院 感染性疾病科
铜是生物体内代谢必需的微量元素之一，铜离子作为辅助因子传递给铜蓝蛋白、金属硫蛋白、细胞色素C氧化酶、铜/锌超氧化物歧化酶、酪氨酸酶、多巴胺-β-单加氧化酶、凝血因子Ⅴ和Ⅷ等，参与能量代谢、抗氧化、形成神经递质、铁代谢等重要生命活动。机体内的铜含量需要维持稳定，铜相关代谢异常会导致一系列机体功能障碍，引起严重的临床症状。遗传性或获得性铜缺乏时，机体许多重要生理功能受损，可表现为卷毛症、癫痫、肌肉神经病变伴一系或多系造血减低；遗传性或获得性铜过载时，则导致过量的铜在组织细胞内蓄积，通过介导氧化应激、诱导细胞凋亡造成组织器官损伤，以肝脏及中枢神经系统功能障碍为主要临床表现。此外，与铜代谢相关的遗传性铜蓝蛋白缺乏症引起继发铁代谢异常，导致系统性铁沉积和脑功能障碍。铜代谢异常相关疾病种类及临床表型较为复杂，本文仅从肝病视角出发，聚焦肝铜代谢疾病，探讨遗传性铜代谢异常的致病机制及临床诊断。由于篇幅所限，铜缺乏性疾病（如Menkes病、Huppke-Brendl综合征等）将不作阐述。
1铜代谢重要环节及其分子机制
体内铜代谢的稳定不仅与食物摄入、胃肠道吸收、血液中的转运、肝胆道排泄及体内的分布有关，也涉及细胞内铜摄取、分配、储存及外排等一系列的环节。正常情况下铜代谢处于稳态平衡，以上各个环节的主要功能蛋白及其修饰和伴侣蛋白的功能障碍都将引起机体铜代谢异常，导致铜缺乏或铜过载性疾病的发生。查阅相关文献资料并参考人类孟德尔遗传数据库（OMIM，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/），将铜代谢的相关蛋白及其疾病表型进行总结，详见表1。



2铜代谢常用生化检查
2.1铜蓝蛋白
铜蓝蛋白为急性反应蛋白，其前体主要于肝脏合成，在高尔基体结合6个铜离子后合成全铜铜蓝蛋白，半衰期由5 h延长至5.5 d。胎儿出生后至6个月内铜蓝蛋白水平最低，新生儿只有正常成人的1/5，早幼期最高0.3~0.5 g/L，正常成人约为0.2~0.35 g/L。铜蓝蛋白是最主要的铜转运载体，血液90%以上的铜经铜蓝蛋白运输至各个器官，实现铜在体内的分布和转运。临床上测定铜蓝蛋白的常用方法有610 nm比色法、铜含量分析法、胺氧化酶活性测定法和免疫散射比浊法，前两者受外界因素干扰较大，胺氧化酶活性测定以盐酸对二苯胺为底物，反应不稳定且有致癌性，限制了其临床应用。免疫散射比浊法敏感度高，操作简便快捷，易在临床上推广应用，但不能区分无铜铜蓝蛋白及全铜铜蓝蛋白，结果可能高于实际浓度，且急性炎症及高雌激素可以导致铜蓝蛋白升高。
2.2尿铜
血清中与白蛋白和氨结合的铜可由尿排出，间接反映血清非铜蓝蛋白结合铜（游离铜）的水平。人体通过肾每天排泄不到摄取铜的3%，正常人尿铜水平多＜40 μg/24 h。24 h尿铜受尿量收集、容器是否含铜、尿量计量准确性及肾脏排泄功能等因素的影响，不适于肾功能不全及衰竭的患者。
2.3血清铜
血清铜由90%以上的铜蓝蛋白结合铜（每毫克铜蓝蛋白含3.15 μg铜）及非铜蓝蛋白结合铜（游离铜）构成，游离铜正常浓度＜15 μg/dl。检测游离铜的方法临床未广泛开展，主要通过计算公式：血清铜（μmol/L）×6?35-铜蓝蛋白（mg/dl）×3.15获得，其准确度依赖于血清铜和铜蓝蛋白的准确性。
2.4肝铜
正常肝铜＜40~55 μg/g（肝干重），其测定受肝铜分布不均、干燥后肝干重微小等因素影响。此外我国肝铜定量检测不易获取，肝脏病理特异性铜染色（罗丹明或地衣红）广泛用于铜过载疾病的诊断，但这类方法仅能检测到溶酶体内的铜，且肝铜在体内分布不均，有报道称肝豆状核变性（WD)患者特异性铜染色阳性率低于10%，因此临床应予以重视。
3常见遗传性铜代谢异常及其致病机制
铜代谢机制由多个通道蛋白、伴侣蛋白和分子共同参与，相应遗传编码基因的突变可导致遗传性铜代谢异常。
3.1肝豆状核变性（WD）
WD是临床上最常见的铜代谢异常疾病，致病基因ATP7B，定位于染色体13q14.3，含21个外显子和20个内含子，编码P型-ATP酶（ATP7B蛋白）。ATP7B基因突变导致ATP7B蛋白功能缺陷，使ATP7B蛋白不能将铜转运至高尔基复合体合成全铜蓝蛋白，不能接收ATOX1蛋白传递的Cu+，和(或)不能随细胞内铜离子浓度变化发生从高尔基体基膜到胞质分泌囊泡的亚细胞转位，将多余铜排泄到毛细胆管，导致铜储积。WD于1912年由Kinnier Wilson医生描述，经过100多年的研究，其发病机制、诊断和治疗手段已逐步完善，但临床上仍存在一些问题，容易导致漏诊和误诊。
3.1.1ATP7B基因检测
WD属常染色体隐性遗传方式，基因水平确诊需满足ATP7B基因纯合致病突变或复合杂合致病突变，单一杂合突变不能确诊。临床支持WD诊断，但ATP7B基因不符合确诊条件时，需注意ATP7B基因检测技术和分析的局限性：（1）不同种族及地区ATP7B基因突变热点不同，我国以8号外显子p.R778L错义突变最为常见，但因ATP7B基因突变类型超过700种，不主张只检测突变热点用于WD的诊断和筛查，容易出现漏诊；（2）目前常用DNA测序技术主要检测外显子，少数WD患者突变类型属于内含子突变，尤其是剪切突变，另外少数突变位点涉及ATP7B基因的启动子区，因此，当临床与基因诊断不相符的情况下，在进行其他病因筛查的同时，建议完善启动子区和内含子测序。临床不支持WD诊断，而ATP7B基因呈现复合杂合突变时需鉴别：（1）两个杂合突变是否来自同一条染色体，家系测序作图分析是最简便的验证方法；（2）区分突变是致病突变还是同义突变或者多态性位点。
3.1.2WD的肝脏表现
WD典型临床三大特点为出现肝损伤、椎体外系症状和角膜K-F环，但WD发病年龄跨度大，临床表型多变，病程进展缓慢不一，累及多器官系统，临床容易误诊。临床中凡不明原因的肝病，包括临床表现为转氨酶升高、肝肿大、肝硬化、急慢性肝炎和肝衰竭等以及病理表现为脂肪肝和自身免疫性肝炎改变等，均要考虑到WD可能性。合并椎体外系症状、关节痛、蛋白尿、溶血、月经失调等肝外表现时，有利于早期发现和诊断WD。急性或慢加急性肝衰竭病例， AST/ALT＞2.2，ALP（U/L）/TBil（mg/dl）＜4、成人ALP＜40 U/L或呈动态下降，合并Coombs阴性溶血，合并尿酸不高的急性肾功能衰竭时有利于WD的诊断。另外，当某一肝病诊断明确后仍出现临床症状、体征与实验室检查不相一致的情况时，如低蛋白血症出现早且严重，但水肿症状较轻；凝血时间明显延长，但消化道症状和出血表现较轻；肝硬化表现显著，但发病年龄小等，均要考虑WD的可能，本院就确诊过多例WD合并HBV感染的患者。
3.1.3WD常用临床检查
3.1.3.1铜蓝蛋白
WD患者由于ATP7B基因缺陷，铜离子不能转运至高尔基复合体，进而导致铜蓝蛋白荷铜障碍，引起铜蓝蛋白半衰期缩短，表现为铜蓝蛋白显著降低。我国以铜蓝蛋白＜0.2 g/L作为诊断WD的标准，＜0.08 g/L是诊断WD的强烈证据。铜蓝蛋白轻中度降低，需注意杂合子、严重肝病、低蛋白血症、肾病综合征等因素影响，其他引起铜蓝蛋白下降的遗传代谢性疾病于下文简述。当临床表现支持WD，但铜蓝蛋白正常时，可能与炎症急性期和高雌激素促进铜蓝蛋白合成或ATP7B蛋白功能改变仅影响铜的排泄而不影响高尔基体定位有关。铜蓝蛋白正常的WD比例国外报道为5%~10%，杨旭教授等报道我国的比例为9.1%。因此，铜蓝蛋白正常不能排除WD，临床需重视。
3.1.3.2尿铜
WD患者由于循环中非铜蓝蛋白结合铜增加，与白蛋白和氨疏松结合，运输至肾脏经尿液排泄增加，尿铜＞100 μg/24 h对WD有诊断价值。然而大约有16%~23%儿童或无症状WD患者尿酮＜100 μg/24 h，因此临床不明原因肝病患者如果尿铜＞40 μg/24 h，需考虑进一步检测以排除WD。青霉胺试验（青霉胺 0.5 g/12 h，餐前1 h口服）亦用于临床WD的诊断，尿铜＞1600 μg/24 h或较基础量升高大于5倍则为阳性，然而有研究显示儿童WD青霉胺试验敏感度仅为12.5%，且对成人的诊断价值亦未得到公认，因此欧洲肝病学会已经不再推荐WD患者进行青霉胺试验。
3.1.3.3角膜
K-F环为铜颗粒沉着于角膜后弹力层而形成的褐色环，是WD的典型特征，见于约98%具有神经系统表现的患者，以及40%~50%具有肝脏表现的患者；无症状WD患者K-F环阳性率低于30%。K-F环并非WD所特有，亦可见于原发性胆汁性胆管炎及家族性肝内胆汁淤积症等慢性肝内胆汁淤积性肝病。
3.1.3.4血清铜
通常WD患者血清铜下降，而游离铜增加（＞25 μg/dl），然而对于WD肝衰竭患者，其短期内肝细胞大量破坏可导致血清铜及游离铜均增高。
3.1.3.5肝铜量
WD是一种铜储积病，美国肝病学会（2008）建议肝铜≥250 μg/g（肝干重）作为WD的诊断标准。杨旭教授等提出将肝铜≥209 μg/g（肝干重）作为WD诊断的临界值，敏感度和特异度分别为99.4%和96.1%，肝型和儿童型WD敏感度可达到100%。胆汁淤积性肝病引起肝铜量显著升高是WD需要重点鉴别的疾病，典型原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎临床容易诊断，对于家族性肝内胆汁淤积性肝病，铜蓝蛋白及ALP水平可协助两者的鉴别，铜蓝蛋白显著降低及成人ALP＜40 U/L或动态下降支持WD诊断。另外，肝穿刺病理组织电镜检查线粒体内基质电子密度增高亦支持WD诊断。
3.1.4诊断
2005年欧洲指南提出将评分系统应用于WD的诊断，包括临床表现（角膜K-F环、神经系统症状、Coombs阴性溶血性贫血）、铜生化学检查（铜蓝蛋白、肝铜、尿铜）和ATP7B基因多个项目，提示WD诊断不是依靠单一指标，而是从基因到临床的综合统一，具体请参考欧美及我国WD诊疗指南。
3.2遗传性铜蓝蛋白缺乏症
遗传性铜蓝蛋白缺乏症于1987年由Miyagima医生描述，是罕见的常染色体隐性遗传性疾病，致病基因CP基因，定位于3q23-25，含19个外显子和18个内含子，编码铜蓝蛋白前体α2球蛋白。CP基因突变：（1）框移突变及无义突变导致铜蓝蛋白的表达量下降；（2）氧化酶活性区域氨基酸点突变导致铜蓝蛋白亚铁氧化酶活性下降；（3）糖基化修饰区氨基酸突变导致铜蓝蛋白滞留在内质网；（4）铜离子结合结构域突变导致铜结合能力下降。铜蓝蛋白是血清中铜转运的主要载体，通过铜蓝蛋白对铜离子的结合和释放，实现铜在体内的分布，但体内还存在其他转运铜的蛋白和分子，如白蛋白、铜转运蛋白、组氨酸、谷胱甘肽等，在遗传性铜蓝蛋白缺乏症中铜的水平可通过其他蛋白和分子代偿，维持铜代谢基本稳定。铜蓝蛋白调节铜代谢，但不可或缺参与铁代谢，细胞内铁以Fe2+形式通过膜铁转运蛋白跨膜转运，铜蓝蛋白利用其亚铁氧化酶活性将Fe2+氧化为Fe3+，Fe3+才能被转铁蛋白结合实现将铁转运至靶细胞。
3.2.1临床表现
遗传性铜蓝蛋白缺乏症导致铁代谢紊乱，Fe2+在肝、胰腺、脑等器官内沉积，而循环中Fe3+缺乏，发病年龄约50岁左右，临床表现为血色病、胰岛素依赖型糖尿病和基底核进行性变性、视网膜变性、皮质下痴呆等神经系统退行性变性症状体征。
3.2.2实验室检查
（1）铜生化学检查：遗传性铜蓝蛋白缺乏症患者表现为无铜蓝蛋白血症，常小于检测下限。血清铜下降，游离铜正常，肝铜含量、尿铜无明显升高。（2）铁生化学检查：血清铁下降，血清铁蛋白升高，转铁蛋白饱和度常＜45%，肝铁沉积。（3）头颅MR：T2加权像大脑皮质、苍白球、豆状核、小脑广泛低信号。
3.3先天性糖基化异常（CDG）
CDG导致的疾病是一组由常染色体隐性遗传引起的糖蛋白合成缺陷。糖蛋白的蛋白糖基化修饰是一个极其复杂的过程，参与其中的酶种类繁多，迄今根据缺陷的酶、缺陷部位报道有100余型。根据病理生理特点分为两类：CDGⅠ型为糖链合成过程中及已合成的糖链与蛋白质多肽链结合过程中发生缺陷而引起的疾病；CDGⅡ型为发生在已与多肽链结合的糖链的延伸、修饰过程中的缺陷，发生于内质网和高尔基体，可影响高尔基体囊泡转运和囊泡内的pH值。CDG累及多个脏器，如神经系统、血液系统、消化系统和生殖系统等，引起多种多样的临床表现，肝脏受累的CDG约占22%。
3.3.1CDG引起铜代谢异常的临床表现
以肝脏为主要表现且影响铜代谢的糖基化缺陷疾病主要有：CCDC115-CDG、TMEM199-CDG、ATP6AP1-CDG，三者共同临床表现为不同程度的肝损伤，伴神经系统症状，实验室检查示低铜蓝蛋白血症、低血清铜，ALP升高和高胆固醇血症。肝损伤从转氨酶升高到肝硬化，甚至肝衰竭，CCDC115-CDG肝脏病理更早期出现桥接坏死，TMEM199-CDG肝脏病理可表现青少年不明原因脂肪肝，ATP6AP1-CDG多伴有低丙种球蛋白血症相关免疫缺陷。CDG导致铜代谢紊乱推测可能机制为：ATP7B蛋白为糖蛋白，其正常功能的维持需要糖基化修饰，糖基化异常引起ATP7B蛋白亚细胞定位障碍，导致铜转运至高尔基复合体及分泌囊泡下降，进而导致铜蓝蛋白下降及肝细胞铜贮积。由于这几类糖基化异常导致铜代谢异常的机制与WD的致病机制非常相似，临床表现难以区别，因此推荐对低铜蓝蛋白伴ALP升高的不明原因肝病患者，尤其ATP7B基因未检测到致病突变的患者，应着重筛查CDG相关疾病。
3.3.2实验室检查
（1）铜生化学检查：铜蓝蛋白下降，血清铜降低，血清游离铜、尿铜可升高，肝铜升高。（2）血液转铁蛋白等电聚焦电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析证实糖基化异常。（3）生化：血清ALP升高、总胆固醇升高、免疫球蛋白下降亦有利于ATP6AP1-CDG的临床诊断。
4不明原因肝病铜代谢异常诊断思路
铜的代谢和分布均与肝脏密切相关，推荐不明原因肝病患者均进行铜代谢筛查，以下根据临床最容易获得的铜生化检查指标（铜蓝蛋白、尿铜、游离铜）进行铜代谢异常的鉴别诊断，具体思路见图1。


图1不明原因肝病铜代谢异常诊断思路
注：①线粒体特征性电镜改变和肝铜≥209 μg/g肝干重；②ATP7B基因纯合或复合杂合致病突变；③诊断线路图参考文献［9］；④胆汁淤积性肝病病因鉴别参考《胆汁淤积性肝病诊断治疗专家共识：2015年更新》；⑤铁超载筛查包括血清铁蛋白、转铁蛋白饱和度及MRI肝铁含量测定；“+”表示有诊断依据，“-”表示无诊断依据
不明原因肝病，铜蓝蛋白下降，但尿铜和(或)游离铜升高，提示游离铜蓄积损伤，病因多见于铜排泄障碍，临床首先进行WD筛查。排除WD后，结合临床，重点进行胆汁淤积性肝病病因筛查，除外原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、药物性肝损伤等常见病因后，进行基因筛查，重点关注ABCB4基因缺陷病（进行性家族性肝内胆汁淤积3型）、CDG相关疾病基因缺陷（先天性糖基化异常）、AP1S1基因缺陷（MEDNIK综合征）等易影响铜代谢的遗传性疾病。
铜蓝蛋白下降，同时尿铜和游离铜正常或减少，提示铜缺乏，饮食和胃肠道疾病所致铜缺乏通过病史容易鉴别，其他遗传性铜缺乏的病因中，如表现明显铁超载，需重点关注遗传性铜蓝蛋白缺乏症。无铁超载的病例进行基因筛查，重点关注ATP7A基因缺陷（Menkes综合征）和SLC33A1基因缺陷（Huppke-Brendl综合征）。
铜蓝蛋白正常，但尿铜和(或)游离铜升高的病例，仍不能排除非铜蓝蛋白结合铜蓄积，从发病率和治疗药物可及性考虑，仍应首先排除WD，伴Coombs阴性溶血、椎体外系症状或角膜K-F环阳性支持WD诊断。其次在病史采集中关注有无铜中毒、遗传性高锰血症及锰中毒可能，均为阴性结果时，可再次进行胆汁淤积性肝病的病因筛查。
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引证本文：陈淑如， 崇雨田， 李新华. 遗传性铜代谢异常的致病机制及临床诊断［J］. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(8): 1667-1672.
本文编辑：葛俊公众号编辑：王亚南